6. Les analyses des mycobactéries

6.1 Généralités


Il existe pour l’envoi d’échantillons avec suspicion de TB / Mycobactériose, des containers que vous pouvez commander en appelant le 044 634 2632. Pour une recherche de bactériologie et de mycobactériologie nous demandons que les échantillons soient envoyés dans des containeurs séparés. Les échantillons doivent être envoyés immédiatement ou conservés au frais (4°C) jusqu'à l’expédition sauf pour le sang.

Pour des cultures de souches de mycobactéries nous vous demandons de l'information supplementaire selon la liste de contrôle.

La liste de contrôle pour des cultures de souches de mycobactéries (PDF, 67 KB)


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6.2 Exigences concernant les échantillons de recherche

6.2.1 Prélèvements contaminés de façon naturelle


Expectoration – crachat

  • Prélèvement : expectoration au lever (avant le petit déjeuner) obtenue après plusieurs inspirations profondes
  • Expectoration induite
    • Physiothérapie
    • Inhalation de quelques gouttes de solution saline hypertonique
    • Expectoration après une bronchoscopie
  • Quantité : 5-10ml
  • Nombre : 3 prélèvements distincts à intervalles de 8 heures minimum entre 2 prélèvements
  • Remarque : Une expectoration induite est à privilégier par rapport au prélèvement du suc gastrique chez l’adulte.

Aspiration bronchique

  • Prélèvement : sécrétion pulmonaire ; produit d’aspiration diluée dans de l’eau distillée stérile
  • Remarque : ne pas utiliser d’anésthesiant local lors du prélèvement ; le premier crachat émit après une aspiration bronchique a souvent une très bonne qualité pour établir le diagnostic

Suc gastrique

  • Prélèvement : à jeun le plus vite possible après le réveil ; rincer l’estomac avec de l’eau distillée ou avec du NaCl 0,9% stérile
  • Quantité : 30-50ml
  • Remarque : le suc gastrique doit être neutralisé avant l’expédition. Vous pouvez commander le tampon en appelant le 0446342632. Le prélèvement de suc gastrique est à recommander chez l’enfant (jusqu'à l’age de 12 ans).

Urine

  • Prélèvement : première urine du matin ; recueil de l’urine au milieu du jet
  • Quantité : 50ml
  • Nombre : 3 prélèvements distincts à intervalle de 1 à 2 jours entre 2 prélèvements

Selles

  • Quantité : 2g
  • Remarque : analyse uniquement chez des malades immunodéprimés

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6.2.2 Spécimens prélevés stérilement

 

Liquide céphalo-rachidien

  • Prélèvement : tube stérile
  • Quantité : 2ml au minimum
  • Remarque : l’analyse de plusieurs prélèvements distincts augmente la sensibilité. Un diagnostic complet ne peut pas être effectué sur une quantité inférieure à 2ml


Liquide pleural

  • Prélèvement : prélever stérilement
  • Quantité : 10ml au minimum
  • Remarque : seule l’analyse d’exsudats est à recommander. L’analyse supplémentaire d’une biopsie pleurale augmente la sensibilité.


Autres liquides (épanchement, abcès …)

  • Remarque : recueillir dans un tube stérile (ne pas utiliser de milieu de transport ni d’écouvillon)


Sang

  • Prélèvement : tube stérile avec anticoagulant
    • Culture : sang hépariné (pas de sang EDTA ou sang citraté)
    • Test moléculaire : sang citraté (pas de sang hépariné)
  • Quantité : 5-7ml
  • Remarque : analyse chez des patients avec suspicion d’une tuberculose miliare


Moelle osseuse

  • Prélèvement : tube stérile avec anticoagulant
    • Culture : sang hépariné ou sang citraté (pas de sang EDTA)
    • Test moléculaire : sang EDTA ou sang citraté (pas de sang hépariné)
  • Remarque : analyse chez des patients avec suspicion d’une tuberculose miliare


Tissus (biopsie ; intra-opératif)

  • Prélèvement : tube contenant une faible quantité de NaCl 0,9% stérile
  • Remarque / observation : Ne pas utiliser de solution de fixation

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6.3 Microscopie


L’examen microscopique est effectué après un prétraitement des prélèvements par la microscopie à fluorescence. Un résultat positif est confirmé par la coloration de Ziehl-Neelsen.

Nous effectuons un examen microscopique sur tous les spécimens exceptés le sang, les os et les selles. L’urine n’est microscopiée que s’il y a suspicion d’une tuberculose urogénitale. Le suc gastrique fait l’objet d’une microscopie si le patient a moins de 13 ans.

Chez les patients pour lesquels l’examen microscopique s’est révélé positif pour la première fois, le résultat est communiqué par téléphone et confirmé par écrit. Le résultat écrit de l’examen microscopique est disponible dans les 24 heures après réception de l’échantillon.

A l’IMM la microscopie directe (d’urgence) par coloration de Ziehl-Neelsen sur des échantillons respiratoires non décontaminés et non enrichis a été remplacée par une Real-Time PCR (GeneXpert, Cepheid). Cette PCR permet une détection rapide d’ADN de mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis dans des spécimens respiratoires non traités (durée de l’examen d’environ 2-3 heures après réception de l’échantillon). Cette PCR possède une sensibilité et spécificité plus élevée que la microscopie directe (d’urgence) effectuée sur des spécimens non traités auparavant.
L’analyse en urgence par Real-Time PCR est effectuée du lundi au vendredi entre 8 heures et 18 heures ainsi que les week-ends et jours fériés entre 8 heures et 16 heures sur demande téléphonique chez l’académicien de garde au 079 / 698 99 90. En dehors de ces heures le laboratoire interdisciplinaire effectue sans préavis une microscopie directe (d’urgence) par coloration de Ziehl-Neelsen sur des échantillons respiratoires non traités.

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6.4 Culture


Pour la plupart des échantillons la mise en évidence de mycobactéries par culture comprend l’inoculation en milieu liquide (BACTEC MGIT 960) et sur un milieu solide (Milieu Middlebrook 7H11).

Les cultures positives font constamment l’objet de rapports écrits. Lorsque la première culture provenant d’un patient devient positive le médecin traitant est informé par téléphone. Les cultures négatives sont définitives et font l’objet d’un rapport après 7 semaines.

La croissance de BAAR à partir de prélèvements positifs à l’examen microscopique a lieu en général après une incubation de 7 à 10 jours, parfois plus tôt. Les prélèvements avec un résultat d’examen microscopique négatif prennent plus de temps en raison du nombre moins élevé de bactéries (environ 2 à 4 semaines).

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6.5 Identification


L' identification des mycobactéries se fait surtout par méthodes moléculaires, c’est à dire par Real-Time PCR (Light Cycler). La différenciation exacte se fait par hybridisation de sondes d’ADN spécifiques pour les mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis et par séquençage pour les mycobactéries non tuberculeuses (gène rRNA 16S, gène rpoB, gène hsp 65 kD).

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6.6 Test de résistance


Test de résistance des mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis

L’ IMM dispose du BACTEC MGIT 960 pour les tests de résistance des mycobactéries tuberculeuses. Normalement les souches de mycobactéries du complexe tuberculosis sont testées pour l’isoniazide, la rifampicine, l’éthambutol et la pyrazinamide avec les concentrations suivantes : INH 0.1 µg/ml ; RMP 1,0 µg/ml, EMB 5,0 µg/ml, PZA 100,0 µg/ml.

Contrairement aux tests traditionnels de résistance bactériologique, le test de résistance pour les mycobactéries tuberculeuses ne comporte pas de méthodes quantitatives (par exemple détermination de la concentration minimale inhibitrice). En effet une seule concentration est testée pour chaque agent antituberculeux (« concentration critique »). Cette concentration n’est cependant pas en rapport avec les concentrations que l’on peut trouver dans le sérum et les tissus. Pour les mycobactéries, on trouve, à côte de niveaux élevés de résistance toute une série de types à niveau intermédiaire et à faible niveau de résistance (mutations, perméabilité des cellules modifiée). Lors de l’examen à la « concentration critique » ces phénotypes se révèlent aussi comme étant résistants. Cette résistance in vitro ne doit absolument pas présager l’échec d’une thérapie in vivo, particulièrement si on considère une thérapie combinée, qui contient des substances agissant sur la paroi des cellules.

C’est pourquoi s’il y a résistance contre les antituberculeux à la « concentration critique », à l’IMM, on élargit les tests de résistance en employant les concentrations suivantes :

INH 0,1 µg/ml, 1,0 µg/ml, 3,0 µg/ml, 10,0 µg/ml
RMP 1,0 µg/ml, 4,0 µg/ml, 20,0 µg/ml
EMB 5,0 µg/ml, 12,5 µg/ml, 50,0 µg/ml

Les résultats de ces tests de résistance permettent une différenciation entre un niveau faible, un niveau intermédiaire et un niveau élevé de résistance et ont ainsi des implications thérapeutiques.
L’IMM élargi aussi les tests de résistance aux antibiotiques de second choix.

Test de résistance des mycobactéries non tuberculeuses (MNT)

En cas de MNT le test de résistance n’est effectué que si le MNT à un rôle pathogène et après consultation du médecin traitant. Les MNT suivants sont le plus souvent la cause d’une pathologie :

MNT à croissance lente:
M. avium-Komplex, M. kansasii, M. malmoense, M. xenopi
MNT à croissance rapide:
M.abscessus-Komplex, M. chelonae, M. fortuitum

Pour les MNT à croissance lente le test de résistance s’effectue en analogie au test de résistance des mycobactéries tuberculeuses avec le BACTEC MGIT 960. A l’IMM on analyse plusieurs concentrations des antibiotiques suivants : clarithromycin, éthambutol, rifabutine, rifampicine, linezolid, moxifloxacine et amikacine. Ceci permet de définir quelle combinaison d’antibiotiques peut être employée pour atteindre un résultat clinique satisfaisant.

En cas de MNT à croissance rapide on détermine la concentration minimale inhibitrice de plusieurs antibiotiques par dilution en milieu liquide sur microplaque. Dépendant de l’identification du MNT à croissance rapide une sélection est faite entre les antibiotiques suivants : clarithromycine, amikacine, tobramycine, gentamicine, cefoxitine, ciprofloxacine, moxifloxacine, levofloxacine, éthambutol, linezolide, minocycline, tigecycline, doxycycline, imipénème, méropénème et clofazimine.

Références:
Springer et al. 2008 J. Clin. Microbiol. 46:4064-4067
Springer et al. 2009 J. Clin. Microbiol. 47:1773-1780
Böttger 2011 Clin. Microbiol. Infect. 17:1128-1134
Lucke et al. 2012 J. Antimicrob. Chemoth. 67:154-158

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6.7 Recherche directe de mycobactéries par PCR


Détection directe de mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis et du genre Mycobacterium (Test COBAS Taqman Mycobacterium tuberculosis, MTB, Genre Mycobacterium)

La détection directe de mycobactéries dans des prélèvements cliniques, à l’exception du sang, des os et des selles, utilise l’amplification d’une partie spécifique de l’ARNr 16S. Dans le cas d’un résultat positif l’examen concomitant du genre Mycobacterium et du MTB permet de savoir très rapidement s’il s’agit de mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis ou de mycobactéries non tuberculeuses. Ces tests sont effectués seulement sur demande du médecin traitant. Une demande est judicieuse en cas de forte présomption de tuberculose, lorsque le patient est immunodéprimé (infection a VIH, transplantation etc…) et/ou en cas de danger épidémiologique momentané.

La mise en évidence d’ADN de mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis est validée pour les prélèvements respiratoires. La sensibilité du procédé moléculaire pour la détection directe des mycobactéries est un peu plus faible que la sensibilité de la culture. Elle est de 90% a 100% pour les prélèvements positifs a l’examen microscopique direct et de 60% a 80% pour les prélèvements négatifs a l’examen microscopique direct. Pour les prélèvements non respiratoires les chiffres concernant la sensibilité et la spécificité divergent considérablement dans les publications, en fonction de l’origine du prélèvement et du prétraitement utilisé.

Le test d’amplification COBAS MTB/Genus est employé tous les jours. Les résultats positifs sont communiqués immédiatement par téléphone. Tous les résultats font l’objet d’un rapport écrit.

Références:
Böddinghaus et al. 1990 J. Clin. Microbiol. 28:1751-1759
Kirschner et al. 1996 J. Clin. Microbiol. 34:304-312
Peter-Getzlaff et al. 2008 J. Clin. Microbiol. 46:4023-4028
Peter-Getzlaff et al. 2010 J. Clin. Microbiol. 48:3943-3948
Bloemberg et al. 2013 J. Clin. Microbiol. 51:2112-2117

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6.8 Mise en évidence génético-moléculaire de résistances


Les résistances aux médicaments tuberculeux sont associées à des mutations dans les gènes mycobactériens respectifs. Les méthodes de biologie moléculaires permettent de détecter de telles mutations et d’avoir rapidement (en 1 à 2 jours) une indication sur le phénotype sensible ou résistant de la souche de mycobactérie tuberculeuse examinée. Le résultat de l’analyse moléculaire doit toujours être confirmé par une recherche conventionnelle de résistances (cf. chapitre 6.6).

A l’IMM la mise en évidence de résistances par méthodes génétiques pour les mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis est effectuée par « line probe assay » (par sondes d’ADN) à partir d’une part d’une culture positive et d’autre part d’échantillons respiratoires dans lesquels de l’ADN mycobactérienne appartenant au complex tuberculosis a pu être détectée par PCR (cf. chapitre 6.7). La résistance à l’isoniazide (gènes inhA et katG) et à la rifampicine (gène rpoB) est examinée dans un premier temps. En cas de mutation prouvée dans au moins un des gènes analysés, la résistance aux fluoroquinolones (gène gyrA), aux aminoglycosides et à la capréomycine (gènes rrs et rpsL) seront alors analysé dans un deuxième temps.

De plus, pour les médicaments antituberculeux suivants un phénotype résistant peut être mis en évidence par séquençage des gènes correspondants : éthambutol (gène embB), linezolide (gène 23S rARN), pyrazinamid (gène pncA), éthionamide (gène ethA).

Un test génético-moléculaire de résistance n’est fait que sur demande du médecin traitant. Une telle demande est recommandée s’il y a suspicion d’une tuberculose résistante (par exemple en cas de provenance d’un pays à haute prévalence de multirésistance ou en cas de traitement antituberculeux précédent).

Référence:
Ritter et al. 2014 J. Clin. Microbiol. 52:940-946

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6.9 Mycobacterium leprae


Généralités
Le diagnostic de la lèpre est tout d’abord clinique. La microscopie par coloration de Ziehl Neelsen des lésions de la peau ainsi que l’examen histologique d’une biopsie de la peau peuvent s’appliquer. Jusqu'à aujourd’hui M. leprae ne peut être cultivé in vitro.

Frotti nasal
Prélever de la muqueuse suspecte dans la partie arrière du septum nasal après un lavement superficiel et une anesthésie sous contrôle visuel puis préparer le frotti

Liquide obtenu à partir d’une lésion sacrifiée de la peau
Prélever en particulier de la matière au bord de plusieurs lésions suspectes et mettre sur une lame

Matière provenant d’une incision de la peau
Au bord des parties suspectes : désinfecter, soulever la peau et pincer entre 2 doigts ; faire une petite incision sur une longueur de 5mm et une profondeur de 2mm (corium) ; tamponner le sang et le liquide puis gratter l’incision pressée et étaler le prélèvement abondamment (en épaisseur) sur une lame.

Note: Un grand nombre de BAAR ne peut être mis en évidence qu’en cas de lèpre lépromateuse. En revanche les BAAR sont pratiquement absents ou en quantité très faible en cas de lèpre tuberculoide.

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6.10 Conservation des échantillons et souches après analyse


Ce qui reste du prélèvement après ensemencement est conservé, pendant toute la durée de l’analyse à 4ºC. Les souches de mycobactéries obtenues après l’examen des échantillons sont conservées pendant 5 ans a -80 ºC (une souche par patient).

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6.11 Typisation génético-moléculaire


Le centre national des mycobactéries a entre autre la mission d’effectuer des examens épidémiologiques permettant particulièrement à identifier les voies de transmission des tuberculoses multirésistantes. Pour cela les laboratoires en suisse envoient toute souche de mycobactérie appartenant au complexe tuberculosis résistante à la rifampicine au centre national des mycobactéries, afin que les cas de tuberculoses multirésistantes soient répertoriés et qu’un typage génétique des isolats soit effectué. La typisation se fait par procédés moleculaires (RFLP et MIRU-VNTR). De plus, grâce à ces procédés, il est possible de déceler une contamination croisée de laboratoire d’un échantillon par un autre.

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6.12 Notification a l’OFSP


Les médecins et les laboratoires sont tenus, conformément à la loi sur les épidémies de déclarer toute tuberculose à l’office fédéral de la sante publique (OFSP). Le médecin traitant est obligé de déclarer le début d’un traitement médicamenteux avec trois antituberculeux différents ou plus dans la semaine. Après identification par culture de mycobactéries du complexe tuberculeux les laboratoires ont l’obligation de remplir un formulaire intitulé « Déclaration laboratoire de tuberculose » et de l’envoyer au médecin cantonal et directement à l’OFSP. Un patient ne doit être déclaré qu’une fois en douze mois. Le résultat des tests de résistance aux antituberculeux de premier choix (isoniazide, rifampicine, éthambutol, pyrazinamid) doit également être annoncé à l’OFSP. Pour cela il est nécessaire d’avoir l’adresse exacte du patient.
La mise en évidence de BAAR par examen microscopique dans un spécimen respiratoire doit être déclaré immédiatement au médecin cantonal.
Le médecin cantonal joue un rôle déterminant dans la lutte contre les maladies contagieuses. Après avoir reçu la déclaration initiale du médecin, il demande au médecin traitant de lui envoyer des informations supplémentaires sous forme d’une déclaration complémentaire. Les maladies résultant de mycobactéries non tuberculeuses ne doivent pas être déclarées.